Mario e Luigi, i gemelli idraulici, applicano il loro motto "Let's-a-go" per risolvere i problemi di ogni giorno nella loro nuova casa del Regno dei Funghi. Mentre sono impegnati ad aiutare la Principessa Peach e a riportare sulla retta via Bowser, rimpicciolito e imprigionato, incontrano un nuovo compagno: Yoshi. La festa di compleanno della Principessa Peach dà luogo a un'avventura galattica, che vede i due fratelli lanciarsi nello spazio per fermare i loschi piani di Bowser Junior e salvare Rosalinda. L'arrivo di due personaggi come Rosalinda e Bowser Junior aggiunge all'avventura un'ulteriore dose di azione e comicità, nonché qualche scioccante rivelazione!
Mario, Luigi, la principessa Peach e Toad, in compagnia del loro nuovo amico Yoshi, un dinosauro verde, partono per una nuova avventura ai confini dell'universo per combattere una nuova minaccia: Bowser Jr, il figlio di Bowser.